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中科院神經所在世界上首次獲得基因敲入的食蟹猴

中科院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組與蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊合作,利用了一種以同源臂介導的末端接合(HMEJ)為基礎的基因敲入策略,在世界上首次獲得了基因敲入的食蟹猴。1月12日,這一重要研究成果以題為《運用CRISPR/Cas9編輯技術獲得基因敲入食蟹猴》在線發表于《細胞研究》期刊。

由于基因修飾猴模型可以用于模擬人類疾病癥狀,因此它可以作為研究人類疾病機制和推進臨床治療的工具。然而,由于普通猴具有繁殖周期長(5-6年一代),幼仔數量少(每胎一只)以及基因編輯效率低等特點,導致構建靶向基因編輯猴具有很大的困難和挑戰性。最近的一些研究表明,CRISPR/Cas9系統可以用于構建基因敲除猴。然而,與基因敲除相反,由于種種原因例如效率低,到目前為止仍然還沒有基因成功敲入猴的報道。

基于實驗室之前的研究,同源臂介導的末端接合(HMEJ)的方法可以有效地在獼猴胚胎上實現高效的靶向基因整合。研究人員進一步優化受精卵注入條件,包括供體質粒濃度以及注射劑量,期望在提高敲入效率的同時保持正常的胚胎發育,進而獲得基因敲入的猴子。具體來說,研究人員在Actb (β-actin)位點插入p2A-mCherry以實現mCherry在Actb啟動子的控制下表達。在經歷完整的懷孕周期后,研究人員成功地獲得了一對雙胞胎猴(#1,雄;#2,雌)和三只單胎的雌性猴(#3、#4和#5)。通過直接表皮熒光觀察兩只新生猴(#1,#5)的腳趾發現,與野生型相比,#1和#5展現出mCherry熒光。對兩只死亡雌猴子(#2,#3)的各個組織進行切片觀察,發現尾巴、腳趾、心臟、肌肉、心臟、腎、大腦和卵巢均顯示出不同嵌合程度的mCherry表達。值得注意的是,研究人員在卵巢的大部分區域都檢測到mCherry的表達,說明基因敲入猴子具有生殖系傳遞的可能性。所有組織的PCR鑒定測序結果都表明在5’和3’連接處的整合是正確的。此外,Southern印跡分析進一步證實# 2和# 3猴的基因整合是正確的且沒有額外的基因隨機整合。

研究人員利用CRISPR/Cas9介導的HMEJ策略,通過一細胞胚胎注射首次成功地獲得了基因靶向整合的食蟹猴。”專家表示,基于其強大的DNA敲入效率和高保真性,HMEJ介導的敲入策略為構建靶向基因修飾的猴模型提供了可能性。

據介紹,這項工作由助理研究員姚璇、博士后劉真與研究生王興在靈長類疾病模型研究組楊輝研究員與蘇州非人靈長類研究平臺主任孫強博士的指導下完成。并得到國家科技重大專項,中科院戰略性先導科技專項, 國家高科技研發項目國家自然科學基金會, 中國青年千人計劃, 中國科學院重大突破項目、國家關鍵技術研發項目, 上海市科學技術委員會項目,中科院百人計劃等項目的資助。


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